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可溶性淀粉合成酶（Soluble starch synthase，SSS）試劑盒說明書

微量法

正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義

SSS（EC 2.4.1.21）通常以游離態(tài)存在于質體基質中，催化淀粉鏈延長，主要負責支鏈淀粉的合成。

測定原理

SSS催化ADPG與淀粉引物(葡聚糖)反應，將葡萄糖分子轉移到淀粉引物上，同時生成ADP，在反應體系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化NADP⁺還原為NADPH，NADPH生成量與前一步反應中ADP生成量呈正比，340nm下測定NADPH增加量即可計算SSS 活性。

需自備的的儀器和用品

紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：40mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 14mL 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑 4℃

保存一周；

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 8mL 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑 4保存一周；

試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 10mL 試劑一充分混勻備用；用不完的試劑 4℃

保存一周；

試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入 500μL 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑 4℃保存一周；

試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入 500μL 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑 4℃保存一周；

粗酶液制備

按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟

1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm，蒸餾水調零。

2、在EP管中按順序加入下列試劑

混勻后立即340nm波長下記錄初始吸光度A1和2min后的吸光度A2，計算ΔA=A2-A1。

注意：試劑二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混勻。

SSS 活性計算

a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

1、按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

SSS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T×稀釋倍數(shù)

=528×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2、按照樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

SSS 活性（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T×稀釋倍數(shù)=528×ΔA÷W

V 反總：反應體系總體積，2.85×10 ^-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；

d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.075 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，2 min；稀釋倍數(shù)：1.73；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量。

b.使用96孔板測定的計算公式如下：

1、按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

SSS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V樣) ÷T×稀釋倍數(shù)

=1056×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

2、按照樣本鮮重計算

單位的定義：每g組織每分鐘催化產生1nmol NADPH定義為一個酶活力單位。

SSS 活性（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T×稀釋倍數(shù)=1056×ΔA÷W

V 反總：反應體系總體積，2.85×10 ^-4 L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.075 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，2 min；稀釋倍數(shù)：1.73；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量。